4 液体菌种生产关键环节和核心技术
4.1 摇瓶培养基配制 配制5L液体培养基，根据配方一称取玉米粉100g，豆粕50g，麦麸25g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁2.5g，蛋白胨5g，红糖30g，葡萄糖25g，CMC-Na1g，放入不锈钢锅中，加水3000mL搅拌溶解，在电磁炉上煮沸持续20分钟后，用双层纱布过滤，将滤液加水至5L，调节pH6.5左右。制作小摇瓶分装在500mL的三角烧瓶中，每瓶装量250mL，并加人5粒小玻璃球，瓶口用棉塞和牛皮纸密封。制作大摇瓶分装在5000mL的三角烧瓶中，每瓶装量2500mL，并加入15粒小玻璃球，瓶口用棉塞和牛皮纸密封。
4.2 摇瓶培养基灭菌 配制好的摇瓶培养基，及时放人电脑控制灭菌器中，在0.13～0.15MPa压力、121℃条件下，灭菌40分钟。
4.3 摇瓶菌种接种 灭菌好的培养基，待温度冷却至28℃以下，在接种箱或超净工作台内无菌条件下接种。每小摇瓶投入约2cm的斜面菌种后。置于摇床上振荡培养；培养后的小摇瓶菌种，扩接到大摇瓶内振荡培养，每小摇瓶菌种扩接一瓶大摇瓶。
4.4 摇瓶菌种振荡培养 大小摇瓶菌种均在摇床上往复振荡，震荡频率为每分钟80～100次，振幅为6～10cm，摇床室的温度控制在24～25℃。一般小摇瓶菌种培养7天扩接到大摇瓶内培养。大摇瓶菌种培养3天扩接到发酵罐内培养。
4.5 发酵罐菌种发酵培养
4.5.1 发酵罐培养基配制。根据以上配方，称量玉米粉2.6kg，豆粕1.3kg，麦麸0.65kg，磷酸二氢钾0.131kg，硫酸镁0.065kg，蛋白胨0.13kg，红糖0.78kg，葡萄糖0.65kg，CMC-Na0.026kg，放入容积为200L不锈钢锅中，加水100L搅拌溶解，煮沸持续20分钟后过滤，将滤液加水至130L，调节pH6.5左右，用增压泵将滤液灌人发酵罐内。
4.5.2 发酵罐灭菌。液体培养基装罐前，将发酵罐在压力0.13～0.15MPa、温度121℃条件下空消2小时，装入液体培养基后，在相同条件下实消40分钟。
4.5.3 液体菌种深层培养。待发酵罐液体内部温度冷却28℃以下。打开培养室内紫外灯照射40分钟进行空间消毒。消毒结束后，在酒精火焰圈无菌条件下打开发酵罐接种口。将培养后的大摇瓶菌种(2500mL)扩接到发酵罐内，接入量为2%(v/v)。关闭接种口，同时打开控气阀门，通人新鲜空气，通气搅拌培养。同时排出发酵过程中的废气。设定发酵罐内培养温度23～25℃。发酵培养3天即可使用。培养过程中，每天取样一次罐内液体，在显微镜下观测有无杂菌感染，若发现污染，尽早处理。
4.6 菌种制作环境因素 严格消毒规程，保持接种室(接种箱)和培养室内适宜的温度和干爽、清洁的空气，降低空气中杂菌基数，是提高菌种培养成功率的关键。另外，在空气压缩机房，接种车间都必须保持环境清洁卫生。
