菌种是从食用菌子实体的孢子或组织体的菌丝或基质的菌丝体分离得到的。分离得到的菌种叫母种，故菌种分离也叫母种分离。
一、种菇的选择：选择出菇早，菇型好，个头符合商品标准并且均匀，生长健壮。产量高，无病虫害，八成熟的子实体。
二、分离方法：通过无菌操作进行孢子分离法、组织分离法、基质分离法等。
1. 孢子分离法：取八成熟的良好种菇，去杂物，用75%酒精抹擦菇体，去除菇柄，放入灭菌的器皿内备用。用一个顶部有孔口的玻璃罩，罩下放一张干净的白纸，白纸上放一培养皿，皿口向上。取一铁丝、双层纱布、棉塞备用。以上物品放在一白瓷盆内，物品全部经灭菌处理。把种菇用铁丝钩着菇盖，菌褶向着培养皿，挂在罩顶的孔，菇体在罩内稍接近培养皿为宜。用棉塞、纱布把罩孔封好。连白瓷盆一起在适温漫射光条件下培养12―20小时。孢子散出，用接种针或接种环取单孢或少数几个孢子在斜面或平板培养基上划线分离，要求无菌操作。把接种的培养基在适温、黑暗条件下培养3―4天可得纯培养菌丝体。孢子分离法还有褶抹法、钩悬法、粘附法。
2. 组织分离法：选择优良种菇，去杂，用75%酒精抹擦菌体，稍干，再用0.1%氯化汞抹擦菌体，用解剖刀从菇体底部轻轻纵向切一刀，然后用手把菇掰开。用解剖刀在菇柄与菇盖之间或菇柄上部挑取0.2立方厘米的小块组织，放入适当的斜面或平板培养基上，在适温、黑暗中培养3―4天，长出白色菌丝体即可，以上全部无菌操作。组织分离法还有菌核分离法、菌索分离法等。
3. 基质分离：以菇木或耳木为例介绍。基质是生育食用菌的木材。在产子实体的季节，选择出菇良好，无病虫害的菇木晾干，截取2厘米长的小段，放在0.1%氯化汞中浸1分钟，再用无菌水冲洗2―3次，吸干水分。用解剖刀把木段四周切去，再把木段切成火柴枝大小的木枝，每木枝去两头，插入或平放在平板培养基内，在适当条件下3―5天长出菌丝体，即得母种，以上必须无菌操作。基质分离还有土壤分离法、培养料分离法等。（华南农业大学 梁志慧）
